Endotoxinas Bacterianas

No post de hoje, trago um texto sobre Endotoxinas bacterianas, escrito pela minha amiga Janaina Fernandes, Bióloga e Farmacêutica, que trabalhou muitos anos com esta análise e tem bem mais propriedade em escrever sobre o assunto do que eu. No laboratório terceirista em que trabalhamos, este ensaio não era realizado pela área de Microbiologia, da qual fui supervisora por 5 anos, havia um laboratório somente para a realização de ensaios de endotoxinas. A Janaina foi supervisora deste setor.

ENDOTOXINAS BACTERIANAS

Todos os produtos estéreis, sejam injetáveis ou não, bem como suas matérias-primas ou materiais envolvidos na fabricação ou embalagem dos mesmos, tem por obrigatoriedade a realização do ensaio de endotoxinas bacterianas.

A Farmacopeia Brasileira 5ª edição define: O teste de endotoxina bacteriana é usado para detectar ou quantificar endotoxinas de bactérias gram negativas presentes em amostras para qual o teste é preconizado.

Utiliza-se o extrato aquoso dos amebócitos circulantes do Limulus polyphemus ou do Tachypleus tridentatus preparado e caracterizado como reagente LAL.

1.TÉCNICAS ANALÍTICAS

Há duas técnicas com sensibilidades diferentes para este teste:

1. MÉTODO DE COAGULAÇÃO EM GEL: baseado na formação de coágulo ou gel (método semi-quantitativo)

2. MÉTODOS FOTOMÉTRICOS quantitativos que incluem:

O MÉTODO TURBIDIMÉTRICO, (baseado no desenvolvimento de turbidez após quebra de um substrato endógeno);

O MÉTODO CROMOGÊNICO (baseado no desenvolvimento de cor após quebra de um complexo peptídeo sintético cromógeno).

Qualquer um destes procedimentos pode ser realizado, a menos que indicado contrário na monografia da substância.

Nota: As quantidades de endotoxinas são expressas em unidades de endotoxina (UE) definidas - 1 UE é igual a 1 UI (unidade internacional).

2. ANÁLISE SEMI-QUANTITATIVA

No método de coagulação em gel, a determinação do ponto final da reação é feita a partir de diluições da substância sob teste em comparação direta com diluições paralelas da endotoxina padrão.

Para a realização desta técnica utiliza-se tubos apirogênicos, micropipetas, ponteiras estéreis apirogênicas, banho-maria ou bloco aquecedor.

Faz-se a curva de calibração diluindo-se o padrão conforme a sensibilidade do lisado utilizado. ¼ , ½, 1 e 2x a sensibilidade do lisado.

Resultado esperado: ¼ (-), ½ (-), 1(+) e 2(+).

Negativo: gel frouxo ou semelhante à água (líquido)

Positivo: gel duro (não se desfaz)

Nota: cuidado ao virar o tubo, não deixar bater para não desestabilizar o gel e gerar um falso negativo.

3. ANÁLISE QUANTITATIVA

Atualmente no mercado, existem diversas marcas e técnicas para a realização da analise quantitativa.

Alguns utilizam placas de fundo chato (Elisa), seja por turbidimetria (turvação) ou cromogênico (formação de cores) o intuito é o mesmo, dizer exatamente quanto de endotoxinas possui a amostra preparada. É uma técnica muito mais precisa, mas exige treinamento do analista.

Deve-se tomar cuidado no preparo da curva de calibração, pipetagem, e alguns deles, o tempo que se leva para colocar o reagente, pois tudo isso pode influenciar no resultado final.

Normalmente, os resultados ficam armazenados no software e é possível localiza-los posteriormente.

Nota: cuidado ao adicionar os dados no sistema, senão a chance de erros de resultado é grande. Deve-se colocar a diluição utilizada ou a concentração final, dependendo o tipo de produto e a forma de expressão do resultado (limite de endotoxinas dado pela monografia).

4.LIMITE DE ENDOTOXINAS E CALCULO DE DILUIÇÃO

O limite de endotoxinas de cada matéria-prima é dado em monografias específicas, seja a Farmacopeia Brasileira, Americana, Japonesa, Britânica, enfim...

Em alguns casos é dado por EU/mg, EU/mL, EU/mg.

Se eu tenho uma monodroga, ou seja, um produto acabado que possui somente um ativo, posso utilizar o mesmo limite da matéria-prima?

Sim. Pode sim, uma vez que somente tem um ativo e normalmente diluído em água ultrapura.

Agora vamos falar somente em situações já conhecidas. Em outro post falaremos em situações onde eu não conheço o limite ou polidrogas.

Devemos fazer o calculo da diluição utilizando a seguinte formula:

MVD = limite de endotoxinas

         Sensibilidade do lisado

Observação: fórmula usada para quando o limite de endotoxina do fármaco especificado na monografia estiver em volume (UE/mL)

Onde:   M: máximo

            V: valor

            D: de diluição

Ou

MVD = limite de endotoxinas . concentração da amostra

                          Sensibilidade do lisado

Exemplos:

1.     Água purificada – limite de endotoxinas: 0,5EU/mL

Sensibilidade do lisado: 0,125EU/mL

MVD = limite de endotoxinas = 0,5 EU/mL = 4 , ou seja, podemos diluir até 4x ou 1:4

                Sens. Lisado           0,125EU/mL

2.     Solução de furosemida 10mg/mL – limite de endotoxinas (FB): 3,6EU/mg

Sensibilidade do lisado: 0,125EU/mL

MVD: limite de endotoxinas . concentração da amostra = 3,6EU/mg . 10mg/mL = 288 x

                      Sensibilidade do lisado                                     0,125EU/mL

Mais uma vez espero que este post ajude à elucidar dúvidas quanto ao ensaio de endotoxinas. Deixem seus comentários, opinião ou dúvidas!

Até a próxima.